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Arène dioxygénases

Publié le 23 janvier 2019



Dr. Yves Jouanneau
Laboratoire Chimie et Biologie des Métaux
CEA-Grenoble
17 avenue des Martyrs
38 054 Grenoble Cedex 09
Tel : 04 38 78 43 10
Fax : 04 38 78 54 87
Les dioxygénases forment une grande famille de métalloenzymes qui catalysent l'incorporation des deux atomes de la molécule d'oxygène dans une vaste gamme de substrats carbonés. Chez certaines bactéries, des enzymes appartenant à la classe des arène dioxygénases s'attaquent à des composés aromatiques ou polyaromatiques, des molécules par nature très stables. L'intérêt de ces enzymes est double :
• les réactions qu'elles catalysent sont regio- et énantiosélectives, générant des molécules chirales utiles en chimie de synthèse,
• elles catalysent la première étape de la biodégradation de nombreux polluants toxiques, parfois récalcitrants, comme les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) (Jouanneau et al., 2011).

Structure et sélectivité des dioxygénases

Nos travaux portent sur des dioxygénases de bactéries du genre Sphingomonas ou Mycobacterium, ayant la propriété remarquable de s'attaquer à des HAP constitués de 4 noyaux aromatiques. La naphtalène dioxygénase de Sphingomonas CHY-1, par exemple, est exceptionnelle par sa faculté d'oxyder 9 des 16 HAP considérés comme polluants prioritaires. C'est la première enzyme caractérisée dotée d'une aussi large spécificité du substrat, capable notamment d'oxyder des HAP à 5 cycles comme le benzo[a]pyrène (Jouanneau et al., 2006).



Schéma de fonctionnement des arène dioxygénases.
Le complexe enzymatique comprend 3 composantes. Deux électrons provenant de l'oxydation du NADH sont transférés via une réductase et une ferrédoxine à la dioxygénase qui catalyse la dihydroxylation stéréo-sélective du substrat pour former un
cis-dihydrodiol.


En collaboration avec des collègues du Brookhaven National Laboratory (Upton, NY, USA), la composante oxygénase de cette enzyme a été cristallisée et sa structure 3D a été élucidée (Jakoncic et al., 2007a, 2007b). Il s'agit un hexamère α3ß3, dont le site actif, un atome de fer ferreux, est porté par chacune des sous unités alpha. Cet atome de fer est situé au fond d'une profonde poche hydrophobe dans laquelle le substrat est positionné de manière à permettre l'hydroxylation sélective de deux carbone adjacents de l'un des noyaux aromatiques. Par ailleurs, grâce à une collaboration avec une équipe belge, nous avons étudié l'activité catalytique d'autres doxygénases, notamment celle de Sphingomonas LB126 qui a la particularité de catalyser une dioxygénation angulaire sur des substrats contenant un cycle non aromatique comme le fluorène ou le dibenzofurane (Schuler et al., 2008, 2009).



Structure cristallographique de la composante catalytique de la dioxygénase de
Sphingomonas CHY-1.
Représentation en 3D de la structure de l'hexamère α3ß3 (à gauche) et du site catalytique dans lequel la molécule de benzo[a]pyrène a été modélisée (à droite).

L'objectif de ces travaux est de mieux comprendre ce qui détermine au niveau moléculaiure la sélectivité catalytique de ce type d'enzymes.

Biodiversité des bactéries et des enzymes impliquées dans la dégradation des HAP

Un autre volet de nos travaux a pour objet de mieux connaître le potentiel de biodégradation des HAP contenu dans un sol pollué. Ce projet est parti du constat que moins de 5% des bactéries du sol sont cultivables, et par conséquent, l'essentiel de la biodiversité et de la richesse microbiologique et biocatalytique du sol est inconnu. L'approche utilisée repose sur une technique de marquage métabolique in situ par un isotope stable ou 'stable isotope probing' (SIP). Cette technique consiste à introduire dans le sol un substrat marqué avec l'isotope 13C du carbone, en l'occurrence le phénanthrène, puis à extraire l'ADN marqué du sol, enfin à identifier par l'analyse de biomarqueurs (ARNr 16S) les bactéries capables de dégrader les HAP. Par ce moyen, la diversité d'un sol d'une installation de traitement d'effluents contaminés aux hydrocarbures (eaux de ruissellement d'autoroute) a été étudiée. Le résultat montre que les Betaprotéobactéries représentées par plusieurs genres bactériens mal connus sont les acteurs majeurs de la biodégradation des HAP in situ (Martin et al., 2012). Plus récemment, nos travaux ont porté sur des bactéries du sol capables de dégrader des HAP adsorbés sur un support hydrophobe. Les résultats montrent que ces espèces, se développant en biofilm à l'interface avec le support hydrophobe, sont de nature différente de celles identifiées précédemment dans le même sol. D'autre part, la nature des genres bactéries qui dégradent les HAP dépend de l'origine géographique du sol. Toutefois, les principaux microorganismes capables de dégrader les HAP dans un sol tropical du Cameroun ont été identifiés comme des espèces de la famille des Rhodocyclaceae, très proches de celles trouvées dans le sol étudié sous climat tempérée (Kom Regonne et al., 2013).



Prédominance des Betaprotéobactéries parmi les bactéries du sol capables de dégrader les HAP.

L'analyse porte sur 427 séquences d'ARN ribosomal 16S amplifiées par PCR à partir d'ADN métagénomique marqué au 13C (marquage SIP pendant 5 jours ). L'assignation des séquences aux phylums ou classes bactériens a été faite grâce à la base de données RDP. Les Protéobactéries des classes Alpha (4%) et Gamma (11%) sont après celles de la classe Beta (67%) les plus représentées parmi les bactéries du sol aptes à dégrader les HAP.

La technique SIP est aussi employée pour identifier les enzymes impliquées dans la dégradation, en analysant les séquences de gènes spécifiques issus du sol. En utilisant des séquences partielles gènes de dioxygénases amplifiées à partir d'ADN du sol, une méthode originale basée sur la construction de gènes hybrides a été mise en œuvre pour reconstituer des dioxygénases fonctionnelles et doser leur activité d'oxydation des HAP. Cette approche est limitée par la stabilité des protéines hybrides étudiées. Néanmoins, l'analyse de plus d'une centaine de séquences a montré qu'on pouvait classer les dioxygénases du sol en 5 groupes distincts, dont deux seulement présentaient des homologies significatives avec des enzymes connues (Martin et al., 2013)

Pour en savoir plus sur la richesse du sol en biocatalyseurs bactériens associés à la biodégradation, une analyse métagénomique a été entreprise en collaboration avec le Génoscope d'Évry. Une expérience de marquage SIP à grande échelle a été effectuée et l'ADN marqué extrait du sol a été soumis à un séquençage haut débit. Sur un total de 283 Mb d'ADN métagénomique déchiffré, la plus grande partie (56%) proviendrait de Betaproteobactéries en accord avec nos analyses des génotypes. Plusieurs dizaines de gènes codant potentiellement des dioxygénases ont été repérés, la plupart d'entre eux ayant peu de ressemblance avec des enzymes connues. Les gènes de structure de 4 dioxygénases ont été clonés et l'activité catalytique des enzymes correspondantes est en cours d'étude.

Ces approches culture-indépendantes ont pour objectif de tirer parti de l'énorme diversité des microorganismes du sol pour isoler des biocatalyseurs plus performants, soit pour la synthèse de molécules chirales, soit pour la biodégradation des polluants.

Actualités scientifiques concernant cette thématique

Caractérisation de nouvelles dioxygénases oxydant les HAP dans le sol
Comme la plupart des bactéries du sol sont non cultivables en laboratoire, il faut recourir à des méthodes moléculaires pour identifier et connaître le potentiel d’espèces spécialisées comme celles qui dégradent les HAP. Grâce à une méthode de marquage isotopique et une approche basée sur le séquençage métagénomique d’ADN du sol, le génome de bactéries impliquées dans la dégradation des HAP a été en partie dévoilé. Grâce à ces données, nous avons cloné 4 dioxygénases très originales tant par leur séquence que par leur activité catalytique d’oxydation des HAP.

Diversité bactérienne et biodégradation des polluants.
Nous avons étudié dans ce travail les bactéries qui jouent un rôle majeur dans la biodégradation in situ des hydrocarbures aromatiques polycycliques. Afin d'identifier ces bactéries dépollueuses, nous avons mis en œuvre des méthodes moléculaires, indépendantes de la culture en laboratoire.
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Biodégradation d’un additif du diesel.
Nous avons réalisé une étude de biodégradabilité d'un additif du diesel, le 2-EHN au cours de laquelle nous avons isolé des bactéries capables de dégrader ce composé de synthèse dont les effets sur l’environnement et la santé humaine sont inconnus. Nous avons de plus, élucidé les étapes de la dégradation du 2-EHN et identifié les enzymes impliquées.
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Des enzymes bactériennes s’attaquent aux polluants.
Nous étudions des bactéries capables de décomposer des polluants organiques toxiques tels que les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) et nous nous s’intéressons à des dioxygénases qui catalysent l’oxydation des HAP. Ces travaux peuvent servir à la conception de biocapteurs environnementaux.
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Caractérisation d'une dioxygénase qui joue un rôle clé dans la dégradation des HAP.
Nous avons purifié et caractérisé une dioxygénase qui catalyse l'étape initiale d'oxydation des hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP). Nos travaux devraient permettre de mieux comprendre ce qui détermine la spécificité et les propriétés catalytiques de l'enzyme. Ces études ont des perspectives d'applications biotechnologiques dans le domaine de la bioremédiation des sites pollués.
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Thèses soutenues

Florence Martin.
Exploration de la biodiversité bactérienne dans un sol pollué par les hydrocarbures : analyse par marquage isotopique du potentiel métabolique et de la dynamique des communautés impliquées dans la dégradation.
[Thèse en ligne]

Élodie Nicolau.
Biodégradation du 2-éthylhexyl nitrate par Mycobacterium austroafricanum IFP 2173.
[Thèse en ligne]

Publications

Harzallah B, Bousseboua H and Jouanneau Y
Diversity shift in bacterial phenol hydroxylases driven by alkyl-phenols in oil refinery wastewaters.
Environmental Science and Pollution Research, 2017, 24(16): 14376-14386

Jouanneau Y, Meyer C and Duraffourg N
Dihydroxylation of four- and five-ring aromatic hydrocarbons by the naphthalene dioxygenase from Sphingomonas CHY-1.
Applied Microbiology and Biotechnology, 2016, 100(3): 1253-1263

Chemerys A, Pelletier E, Cruaud C, Martin F, Violet F and Jouanneau Y
Characterization of novel polycyclic aromatic hydrocarbon dioxygenases from the bacterial metagenomic DNA of a contaminated soil.
Applied and Environmental Microbiology, 2014, 80(21): 6591-600

Kom Regonne R, Martin F, Mbawala A, Ngassoum MB and Jouanneau Y
Identification of soil bacteria able to degrade phenanthrene bound to a hydrophobic sorbent in situ.
Environmental Pollution, 2013, 180: 145-151

Martin F, Malagnoux L, Violet F, Jakoncic J and Jouanneau Y
Diversity and catalytic potential of PAH-specific ring-hydroxylating dioxygenases from a hydrocarbon-contaminated soil.
Applied Microbiology and Biotechnology, 2013, 97(11): 5125-5135

Esbelin J, Jouanneau Y and Duport C
Bacillus cereus Fnr binds a 4Fe-4S cluster and forms a ternary complex with ResD and PlcR.
BMC Microbiology, 2012, 12: art.125

Martin F, Torelli S, Le Paslier D, Barbance A, Martin-Laurent F, Bru D, Geremia R, Blake G and Jouanneau Y
Betaproteobacteria dominance and diversity shifts in the bacterial community of a PAH-contaminated soil exposed to phenanthrene.
Environmental Pollution, 2012, 162: 345-353

Jouanneau Y, Martin F, Krivobok S and Willison J
Ring-hydroxylating dioxygenases involved in PAH biodegradation: Structure, function and biodiversity.
In A-I Koukkou ed., Microbial bioremediation of non-metals: Current research, 2011, pp. 149-175, Caister Academic Press, Norfolk, UK

Schuler L, Jouanneau Y, Ni Chadhain SM, Meyer C, Pouli M, Zylstra GJ, Hols P and Agathos SN
Characterization of a ring-hydroxylating dioxygenase from phenanthrene-degrading Sphingomonas sp. strain LH128 able to oxidize benz[a]anthracene.
Applied Microbiology and Biotechnology, 2009, 83(3): 465-475

Schuler L, Ni Chadhain SM, Jouanneau Y, Meyer C, Zylstra GJ, Hols P and Agathos SN
Characterization of a novel angular dioxygenase from fluorene-degrading Sphingomonas sp. strain LB126.
Applied and Environmental Microbiology, 2008, 74(4): 1050-1057

Jakoncic J, Jouanneau Y, Meyer C and Stojanoff V
The catalytic pocket of the ring-hydroxylating dioxygenase from Sphingomonas CHY-1.
Biochemical and Biophysical Research Communications, 2007a, 52(4): 861-866

Jakoncic J, Jouanneau Y, Meyer C and Stojanoff V
The crystal structure of the ring-hydroxylating dioxygenase from Sphingomonas CHY-1.
Febs Journal, 2007b, 274(10): 2470-2481

Jouanneau Y, Micoud J and Meyer C
Purification and characterization of a three-component salicylate 1-hydroxylase from Sphingomonas CHY-1.
Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73(23): 7515-7521

Jouanneau Y and Meyer C
Purification and characterization of an arene cis-dihydrodiol dehydrogenase endowed with broad substrate specificity toward polycyclic aromatic hydrocarbon dihydrodiols.
Applied and Environmental Microbiology, 2006, 72(7): 4726-4734

Jouanneau Y, Meyer C, Jakoncic J, Stojanoff V and Gaillard J
Characterization of a naphthalene dioxygenase endowed with an exceptionally broad substrate specificity toward polycyclic aromatic hydrocarbons.
Biochemistry, 2006, 45(40): 12380-12391

Jouanneau Y, Willison JC, Meyer C, Krivobok S, Chevron N, Besombes JL and Blake G
Stimulation of pyrene mineralization in freshwater sediments by bacterial and plant bioaugmentation.
Environmental Science and Technology, 2005, 39: 5729-5735

Demaneche S, Meyer C, Micoud J, Louwagie M, Willison JC and Jouanneau Y
Identification and functional analysis of two aromatic ring-hydroxylating dioxygenases from a Sphingomonas strain degrading various polycyclic aromatic hydrocarbons.
Applied and Environmental Microbiology, 2004, 70: 6714-6725

Krivobok S, Kuony S, Meyer C, Louwagie M, Willison JC and Jouanneau Y
Identification of pyrene-induced proteins in Mycobacterium sp. 6PY1: Evidence for two ring-hydroxylating dioxygenases.
Journal of Bacteriology, 2003, 185: 3828-3841


Publications liées à d'autres thématiques de recherche

Nicolau E, Kuhn L, Marchal R and Jouanneau Y
Proteomic investigation of enzymes involved in 2-ethylhexyl nitrate biodegradation in Mycobacterium austroafricanum IFP 2173.
Research in Microbiology, 2009, 160(10): 838-847

Solano-Serena F, Nicolau E, Favreau G, Jouanneau Y and Marchal R
Biodegradability of 2-ethylhexyl nitrate (2-EHN), a cetane improver of diesel oil.
Biodegradation, 2009, 20(1): 85-94

Esbelin J, Jouanneau Y, Armengaud J and Duport C
ApoFnr binds as a monomer to promoters regulating the expression of enterotoxin genes of Bacillus cereus.
Journal of Bacteriology, 2008, 190(12): 4242-4251

Nicolau E, Kerhoas L, Lettere M, Jouanneau Y and Marchal R
Biodegradation of 2-ethylhexyl nitrate (2-EHN) by Mycobacterium austroafricanum IFP 2173.
Applied Environmental Microbiology, 2008, 74(20): 6187-6193