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Formation de la liaison CS

Publié le 23 janvier 2019
Responsable



Dr. Étienne Mulliez
Directeur de Recherches CNRS

Laboratoire Chimie et Biologie des métaux
CEA-Grenoble
17 rue des Martyrs
38 054 Grenoble cedex 09
Tel. : (33) 4 38 78 91 07

Projet de recherche

La question de la formation de la liaison C-S en Biologie : une chimie «radicalement» nouvelle
Ce projet est mené avec la participation active des Dr. Sandrine Ollagnier de Choudens et M. Atta.

Il y a un contraste frappant entre l'étendue des connaissances concernant la formation de liaisons C-O en Biologie et la pauvreté de celles concernant la liaison C-S. L'insertion d'un atome d'oxygène dans une liaison C-H implique souvent une étape préalable d' « activation » de l'oxygène (monooxygénases) ou l'utilisation de formes réduites de celui-ci (peroxydases). Les mécanismes d'insertion d'un atome de soufre sont largement ignorés et la question de savoir comment le soufre est «activé» pour de telles réactions est un enjeu important dont on peut attendre des retombées économiques intéressantes. En Biologie un nombre relativement restreint de molécules soufrées essentielles ont été répertoriées mais les mécanismes présidant à leur synthèse sont largement inconnus. La réaction d'insertion d'un atome de soufre au sein d'une liaison C-H non activée est chimiquement difficile et il est remarquable que la principale stratégie sélectionnée par l'évolution repose sur la chimie radicalaire.

Notre groupe a une expérience de plus de 10 ans dans l'étude d'enzymes, reconnues récemment comme faisant partie d'une superfamille dite «Radical SAM», qui associent la S-Adénosyleméthionine (SAM) et un centre [4Fe-4S] particulier pour générer de façon contrôlée un radical adénosyle (Ado•). Ce radical est capable d'activer un substrat chimiquement inerte en une espèce radicalaire hautement réactive laquelle est alors susceptible de se combiner avec une source de Soufre pour former le dérivé soufré correspondant :


Le laboratoire étudie les mécanismes d'insertion de Soufre sur 2 systèmes appartenant à cette nouvelle classe d'enzymes.
Le premier concerne la protéine MiaB qui introduit un atome de soufre en position 2 de l'adénine 37 adjacente à la partie anticodante d'un ARN de transfert (Figure 1). Cette modification assure une haute fidélité au décodage génétique.



Figure 1

Le deuxième concerne la biotine synthase (BioB) qui catalyse la formation du cycle thiophane de la biotine (Figure 2). La biotine (vitamine H) est le cofacteur essentiel de certaines décarboxylases et a une importance économique majeure dans les domaines de la santé et des biotechnologies. Les besoins mondiaux sont actuellement de 30 t/an produites chimiquement par un procédé comprenant une dizaine d'étapes.



Figure 2

Malgré des efforts soutenus depuis plus de 15 ans ces 2 systèmes sont incapables de fonctionner de façon catalytique in vitro et ce problème constitue l'obstacle principal à la production de biotine par voie biologique.
Les objectifs du projet sont les suivants :

  1. Découvrir les conditions permettant à ces systèmes de fonctionner de façon catalytique in vitro. Il est possible que des partenaires protéiques, non encore identifiés, soient requis pour cela. Nous comptons explorer cette hypothèse par des techniques de biologie moléculaire (double hybride) et de biochimie (TAP-TAG, fractionnement).

  2. Identifier le donneur direct de soufre. À ce jour, deux hypothèses sont proposées. Dans la première, un sulfure pontant d'un deuxième centre Fer-Soufre, ([2Fe-2S] pour BioB et [4Fe-4S] pour MiaB) serait le précurseur direct du soufre inséré dans le substrat. Cette proposition intéressante en ce qu'elle établirait une nouvelle fonction pour ces cofacteurs métalliques reste néanmoins à vérifier. La deuxième hypothèse est basée sur la présence de soufre de type sulfane (S0 et/ou S-1) dans ces protéines sous forme de persulfure/polysulfure qui pourrait réagir avec le substrat activé par voie radicalaire.
    Résoudre cette question devrait donner des clés nouvelles pour le premier objectif. On peut effectivement penser que l'identification du donneur de soufre permettrait de mieux définir les conditions de régénération de l'enzyme pour un deuxième cycle catalytique.
Le travail au laboratoire porte sur l'étude de ces mécanismes à l'aide de protéines purifiées et de mutants dirigés, en utilisant un grand nombre de techniques spectroscopiques et biochimiques.

Les réactions de transfert de radical intra et interprotéique : Étude cristallographique du complexe 1 :1 formé par la ribonucléotide réductase anaérobie et son « activase »
Ce projet est mené en collaboration avec Le Dr. D. Logan, Université de Lund (Suède).

Ce projet est basé sur les connaissances accumulées depuis plus de 15 ans sur une enzyme essentielle du métabolisme anaérobie : la ribonucléotide réductase de classe III qui, chez les anaérobes catalyse la formation des 4 desoxyribonucléosides triphosphates (dNTP) nécessaires à la synthèse et la réparation des chaînes d'ADN. La RNR III contient dans sa forme active un radical glycinyle essentiel à son activité. Ce radical active le ribonucléotide substrat qui peut alors être réduit en 2' du ribose. Ces enzymes sont particulièrement intéressantes à étudier du point de vue des mécanismes allostériques qui dirigent la synthèse d'un des dNTPs plutôt qu'un autre mais aussi du point de vue de l'utilisation de la chimie radicalaire en biologie. Comment des entités radicalaires hautement réactives sont générées, contrôlées et acheminées vers leur cible ?

 
Figure 3 : Le site « Zn » de la RNR III du bactériophage T4 (D. Logan et al., PNAS, 2003)
Le projet a pour ambition de cristalliser la RNR III d'un organisme thermophile, T. maritima, sous forme du complexe αß entre la réductase et son enzyme activatrice. Les études récentes réalisées sur l'enzyme de E. coli montrent que la formation et la stabilité du radical glycinyle est contrôlée par la structuration d'un site Zn(Cys)4 à proximité ?

Des études similaires avec des mutants appropriés seront entreprises avec l'enzyme thermophile et devraient donner, grâce à la cristallographie, une image détaillée de la façon dont fonctionnent ces enzymes radicalaires.