Thèse soutenue le 06 décembre 2018 pour obtenir le grade de docteur de la Communauté Université Grenoble Alpes - Spécialité : Chimie Biologie
Résumé :
La résistance aux antibiotiques par les micro-organismes est une menace mondiale. C'est pourquoi la recherche de nouveaux médicaments revêt une importance capitale de nos jours.
Le nicotinamide adénine dinucléotide (NAD) est un cofacteur essentiel et un substrat dans de nombreuses réactions biologiques. Pour cette raison, les enzymes qui l'utilisent comme substrat et celles qui participent à sa biosynthèse sont largement étudiées en tant que cibles antibactériennes potentielles. Dans ce contexte, nous nous intéressons au développement de nouveaux agents antibactériens contre la quinolinate synthase (NadA). Cette enzyme participe à la voie de biosynthèse de novo du NAD chez les procaryotes et est essentielle chez deux pathogènes :
Helicobacter pylori, responsable d'ulcères et de cancers gastriques, et
Mycobacterium leprae, responsable de la lèpre. Le fait que NadA n'existe que chez les procaryotes et qu'elle est essentielle chez deux agents pathogènes font de NadA une cible intéressante pour la conception de nouveaux antibactériens. La quinolinate synthase est une enzyme [4Fe-4S] où l'un des atomes de Fe est coordonné par une molécule d'eau à l'état de repos et joue le rôle d'acide de Lewis durant la catalyse. La réaction catalysée par NadA consiste en la formation d'acide quinolinique (QA), précurseur du NAD, à partir d'iminoaspartate et de dihydroxyacétone phosphate. Sur la base de la découverte dans notre laboratoire du premier inhibiteur de NadA (le DTHPA), qui agit par coordination irréversible du fer catalytique du cluster, nous avons conçu et synthétisé une famille de molécules pouvant servir d'inhibiteurs plus spécifiques de NadA. Ces molécules contiennent un cycle benzène / pyridine ou pyrazine, deux carboxylates vicinaux et un thiol en tant que groupe coordinant du fer : l’acide 4-mercaptophtalique (4MP), l’acide 6-mercaptopyridine-2, 3-dicarboxylique (6MPDC), l’acide 5-mercaptopyrazine-2, 3-dicarboxylique (5MPzDC) et l’acide 5-mercaptopyridine-2, 3-dicarboxylique (5MPDC). Nous avons démontré que ces molécules inhibent l’enzyme NadA
in vitro avec un IC
50 du même ordre de grandeur que celui du DTHPA (dizaine de µM). Par l’utilisation de diverses spectroscopies et de la cristallographie, nous avons démontré que l'inhibition s’effectue par la coordination de ces molécules avec le fer catalytique du cluster via leur groupement thiol. Nous avons également étudié
in vitro la spécificité de ces molécules. Nous avons montré que les molécules 4MP et 5MPDC étaient des inhibiteurs spécifiques de NadA lorsqu’on les teste sur l’aconitase B, une enzyme [4Fe-4S] bactérienne, dont le cluster présente des propriétés structurales et fonctionnelles similaires à celles du cluster de NadA.
Enfin, nous avons étudié l'activité d'inhibitrice de l’ensemble des molécules
in cellulo sur de la voie de biosynthèse du QA chez
Escherichia coli avec le DTHPA comme contrôle. Alors que les molécules 6MPDC et 5MPzDC inhibent la croissance d’
E. coli de manière indépendante de la voie de biosynthèse du QA, le 4MP et le 5MPDC (les deux inhibiteurs spécifiques
in vitro) n'ont montré aucune activité inhibitrice
in cellulo. Ce manque d'activité pouvant être dû à un manque de pénétration des molécules à l'intérieur des bactéries, nous avons envisagé de favoriser la pénétration à l'aide d'un vecteur transmembranaire, un analogue simplifié du tétra-cyclopeptide naturel FR235222. Nous avons synthétisé et couplé le cyclopeptide à l'inhibiteur 4MP. Malheureusement, aucune inhibition de la croissance d'
E. coli n'a été observée. La thèse s’est terminée en essayent de comprendre la pénétration du tétra-cyclopeptide sur bactérie, en utilisant notamment des agents fluorophores.
Jury :
Président : Monsieur David Pignol
Rapportrice : Madame Myriam Seemann
Rapporteur : Monsieur Erwan Galardon
Examinatrice : Madame Isabelle Schalk
Examinateur : Monsieur Nicolas Spinelli
Invité : Monsieur Yung-Sing Wong
Invité : Monsieur Olivier Hamelin
Directrice de thèse : Madame Sandrine Ollagnier
Mots clés :
Antibactérien, Prodrogue
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