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Protéines métallo-régulatrices et leur implication dans la virulence bactérienne

Publié le 23 janvier 2019

Isabelle Michaud-Soret, chercheur DR2 CNRS
Roger Miras, technicien supérieur CEA


Bien que de nombreux métaux soient essentiels à la vie, ils sont toxiques à haute concentration et leur concentration intracellulaire est strictement contrôlée par les protéines métallo-régulatrices qui modulent l'expression des gènes impliqués dans le transport, le stockage et le métabolisme des métaux.

Dans le groupe nous étudions plus particulièrement deux protéines métallo-régulatrices FUR et NikR de Escherichia coli (Ec) et de Helicobacter pylori (Hp; un pathogène humain associé avec les cancers et ulcères de l'estomac). Ceci afin de comprendre leur mécanisme d'action et de voir si elles peuvent constituer de bonnes cibles antibactériennes.
Ces deux régulateurs transcriptionnels ne sont pas seulement impliqués dans l'homéostasie des métaux mais sont des régulateurs globaux contrôlant une grande variété de gènes. De plus, dans H. pylori, FUR et NikR font partie d'un fascinant réseau de régulation croisées qui est essentiel pour la virulence. Le lien entre l'homéostasie des métaux et la virulence est d'ailleurs prouvé dans de nombreux cas.
Les mécanismes moléculaires de l'activation (par liaison de l'ion métallique à la protéine et interaction du complexe protéine-métal avec l'ADN ont été étudiés par des approches pluridisciplinaires combinant la biologie moléculaire, la biochimie et des études biophysiques (spectroscopiques et structurales) pour corréler les observations biologiques aux comportements moléculaires.

Ces études nous ont permis d'obtenir les informations mécanistiques sur FUR et NikR qui sont résumées ci-dessous :
• La caractérisation structurale (RMN et rayons-X), le rôle du zinc et des cystéines dans le processus de dimérisation de FUR d'Escherichia coli (EcFUR) [Pecqueur et al., 2006 ; D'Autreaux et al., 2007] et HpFUR [Vitale et al., 2009 ; Dian et al., 2011] (Coll. IBS) ainsi que des données de modélisation du site de liaison du Fe(II) régulateur [Ahmad et al., 2009] (Coll. R Ahmad, Trömso, Norway) ont été obtenus.
• L'importance de l'étroite proximité de la tyrosine 55 (dans l'hélice de reconnaissance pour la liaison de l'ADN) avec un doublet de thymine très conservé dans les boîtes FUR trouvées dans les régions promotrices des gènes contrôlés par FUR a été démontrée par des études de pontages FUR-ADN suivies par spectrométrie de masse. Cette tyrosine, essentielle pour l'interaction protéine/AND est conservée dans toutes les protéines FUR et FUR-like [Tiss et al., 2005] (Coll. IBS).




FUR de Helicobacter pylori est impliquée dans la réponse au stress acide et est importante pour la colonisation gastrique dans des modèles animaux. Nous avons récemment obtenu la structure cristallographique d'un mutant de HpFUR fonctionnellement actif (HpFUR2M ; C78S-C150S) lié à du zinc(II) [Dian et al., 2011]. Cette structure met en évidence une extension N-terminale structurée unique ainsi qu'une hélice C-terminale inhabituelle. La structure montre aussi trois types de sites métalliques : S1 le site structural ZnS4 préalablement caractérisé [Vitale et al., 2009] et deux sites à zinc identifiés dans d'autres protéines FUR. Ces deux sites influencent l'affinité de liaison à l'ADN d'HpFUR, mais seul un des deux est absolument requis pour la liaison à l'ADN et est responsable du changement conformationnel induit par la liaison du métal L'autre site est un site secondaire.

• L'importance de la liaison du Ni(II) à EcNikR et HpNikR en fonction du pH et son rôle dans le contrôle de l'homéostasie du nickel en réponse à l'acidité ont été étudiés [Fauquant et al., 2006] et nous avons démontré une affinité sous-micromolaire de EcNikR pour le Ni(II) [Diederix et al., 2008] (Coll. MA Mandrand, INSA Lyon ; L Terradot, ESRF ; H de Reuse, Institut Pasteur). Le rôle d'un site secondaire de liaison du métal a été élucidé dans HpNikR en utilisant des caractérisations structurales, spectroscopiques et fonctionnelles [Bahlawane et al., 2010 ; Muller et al., 2011]. Ce site secondaire est proposé moduler la liaison de HpNikR sur certains promoteurs en réponse à d'autres ions métalliques que le nickel. Ce résultat est une démonstration intéressante des interférences qui existent entre les homéostasies des métaux.



A) un nouveau mécanisme de régulation de HpNikR dépendant du métal et
B) caractérisation structurale et
C) spectrocopique


De plus, afin de tester FUR comme nouvelle cible antibactérienne, nous avons utilisé la technologie des aptamères peptidiques (protéines combinatoires constituées d'une plateforme constante et d'une boucle peptidique variable). Quatre aptamères peptidiques anti-FUR ont été sélectionnés pour leur capacité à interagir avec EcFUR par criblage d'une banque de 20 millions de molécules en utilisant un test double-hybride dans la levure). Ces 4 molécules inhibent spécifiquement FUR in vivo et in vitro et affectent la virulence d'une souche d'E. coli pathogène dans un modèle d'infection de la drosophile [Abed et al., 2007]. Ce sont des molécules phares pour la découverte de futurs agents antibactériens. De plus, cette étude a permis de souligner l'intérêt des aptamères peptidiques comme outils pour décortiquer un réseau complexe de régulations (Coll. P Colas : ENS Lyon and Aptanomics start-up et S Crouzy, LCBM).