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Transporteurs de métaux - mécanisme et sélectivité

Publié le 23 janvier 2019
Patrice Catty, chercheur CEA
Roger Miras, technicien supérieur CEA

Thématiques de recherche

Nous nous consacrons depuis plusieurs années à l'étude de transporteurs membranaires de métaux de transition, transporteurs appartenant à la famille des ATPases de type P. Les ATPases de type P sont des protéines membranaires qui transportent des métaux contre leur gradient de concentration en utilisant l'énergie fournie par l'hydrolyse de l'ATP (Figure 1).

Figure 1 : Au sein de l'ATPase de type P, le transport de l'ion, dans le sens opposé au gradient de concentration, est couplé à l'hydrolyse d'une molécule d'ATP. L'ATPase de type P est phosphorylée de manière transitoire au cours du transport.

Spécialisées dans le transport de Cu(I), Ag(I), Cd(II), Co(II), Pb(II) ou Zn(II), les ATPases de type PIB (Figure 2) participent avec d'autres transporteurs au maintien dans la cellule d'une concentration non toxique de ces métaux.



Figure 2 : Organisation structurale des ATPases de type P. Les ATPases possèdent un domaine catalytique constitué des domaines A (actuator), P (phosphorylation) et N (liaison du nucléotide). Elles sont ancrées dans la membrane par un domaine membranaire de taille variable (6-12 hélices α). Une classification des ATPases de type P a été proposé par Palmgren and Axelsen (1998) qui rend compte de la sélectivité ionique de ces transporteurs. Les ATPases de transport des métaux lourds possède à la différence des autres ATPases de type P 1 à 6 domaines cytoplasmiques N-terminaux de liaison des métaux (MBD).

Nous étudions quatre protéines de cette famille, impliquées dans le transport de Cd(II), Co(II) et Cu(I) au travers des membranes cellulaires.

CadA, l'ATPase-Cd(II) de Listeria monocytogenes, considérée comme la protéine modèle du type PIB
CoaT, l'ATPase-Co(II) de Synechocystis PCC6803, essentielle à la survie de la bactérie en milieu contaminé en cobalt
Ccc2, l'ATPase-Cu(I) de Saccharomyces cerevisiae, modèle des ATPases-Cu(I) humaines
• En collaboration avec le laboratoire LPCV (CEA-Grenoble), nous travaillons aussi sur PAA1, une ATPase-Cu(I) de l'enveloppe du chloroplaste

Un résumé des bienfaits et méfaits des métaux auxquels nous nous intéressons suit. Quelques soient leurs effets sur le Vivant, Cd(II), Co(II) et Cu(I) ont en commun des propriétés chimiques qui les rendent capables de liaisons covalentes avec les atomes de soufre (cystéines et méthionines) et les atomes d'azote des histidines.

Le cadmium constitue l'un des principaux polluants environnementaux d'origine anthropogénique. Au niveau cellulaire, le cadmium est connu pour provoquer des lésions de l'ADN et inhiber certains systèmes de réparation du matériel génétique. Sa toxicité se manifeste aussi par une perturbation de l'homéostasie de certains métaux physiologiques tels que le calcium ainsi que par l'inhibition de l'activité de certaines enzymes. Enfin, le cadmium peut de manière indirecte générer un stress oxydant au sein de la cellule. La réponse du vivant aux effets cytotoxiques du cadmium fait intervenir trois types complémentaires de réponses cellulaires : la complexation, la séquestration et l'efflux du métal. La complexation implique généralement de petites protéines cytoplasmiques de type glutathion ou phytochelatine qui par leur propriétés chimiques lient le cadmium pour réduire sa réactivité chimique. La séquestration consiste en un isolement du métal au sein d'un compartiment donné de la cellule. L'efflux de cadmium est quant à lui essentiellement assuré par des ATPases de type PIB capable d'expulser le Cd(II) vers le milieu extérieur permettant ainsi la survie des microorganismes dans des milieux pollués.

Connu pour être associé à la vitamine B12, le cobalt est aussi le cofacteur de certaines enzymes bactériennes et humaines. Il peut être toxique chez l'homme où il est classé comme potentiellement cancérigène. A l'état de traces dans les milieux naturels, le cobalt peut se concentrer près de mille fois dans les milieux pollués. Il est tentant dans ces conditions de relier la prolifération de cyanobactéries dans les mares ou les rivières polluées à la présence d'ATPases dont CoaT est pris comme modèle. Ces ATPases très peu étudiées jusqu'à présent n'existent que dans un petit nombre d'espèces bactériennes dont les cyanobactéries, M. tuberculosis et certains pathogènes responsables d'infections nosocomiales. Ces ATPases seraient indispensables à leur survie en milieu hostile (on rappelle que de nombreux métaux sont connus et utilisés en milieu hospitalier pour leur activité bactéricide). L'étude de CoaT est menée dans le but d'obtenir une connaissance suffisamment précise du mécanisme de transport de Co(II) pour envisager de trouver un inhibiteur spécifique de la protéine.

Le cuivre est un métal essentiel à la vie de la cellule car ses propriétés redox et le couple Cu(I)/Cu(II) en font un cofacteur de nombreuses réactions enzymatiques chez tous les organismes vivants. Chez les mammifères, il existe deux ATPases à Cu(I) et deux maladies génétiques sévères associées à des mutations de leurs gènes, les maladies de Menkes et de Wilson. La levure possède une ATPase-Cu(I) qui sert de modèle pour l'étude des ATPases humaines. Chez les eucaryotes, les ATPases-Cu(I) situées dans les membranes de l'appareil de Golgi approvisionnent en cuivre certaines protéines de la voie sécrétoire. En cas d'envahissement de la cellule par le cuivre, des vésicules migrant vers la membrane plasmique déplacent ces ATPases, assurant ainsi la détoxication de la cellule. C'est par cette migration de vésicules vers la membrane plasmique que se produit l'assimilation du cuivre par l'intestin et la détoxication du cuivre dans le foie.

Site de transport des métaux des ATPases de type PIB , déterminant principal de la sélectivité ionique du transporteur

En nous inspirant des travaux réalisés sur l'ATPase-Ca(II) du réticulum sarcoplasmique (
Figure 3), la mieux connue des ATPases de type P, nous cherchons à comprendre comment un métal de transition traverse la membrane au travers de la protéine.



Figure 3 : Images des trois structures tridimensionnelles d'ATPases de type P résolues à ce jour. De gauche à droite: ATPase-Ca2+ SERCA1a, ATPase-Na+/K+, ATPase-H+.

Alliant, biologie moléculaire, expression hétérologue et analyse fonctionnelle par des méthodes biochimiques [Bal et al., 2001 ; Bal et al., 2003), nos travaux ont mis en évidence le rôle essentiel et distinct de deux cystéines de la 6ème hélice membranaire de Ccc2 et CadA, et précisé les acides aminés des sites de transport de Cd(II) [Lowe et al., 2004 ; Wu et al., 2004 ; Wu et al., 2006a]. Ces travaux se poursuivent avec notamment sur CadA le développement d'un volet structural en collaboration avec le laboratoire de Thomas Sorensen à Oxford (UK).

Régulation de l'activité des ATPases-Cu(I) par phosphorylation

Une des particularités des ATPases-Cu(I) d'eucaryotes réside dans leur régulation par des kinases et phosphatases, protéines qui en alternant phosphorylation et déphosphorylation de certains acides aminés de l'ATPase-Cu(I) modulent la vitesse du cycle de transport du Cu(I). Nous étudions le rôle de sérines susceptibles d'être des sites d'action de kinases et phosphatases dans le fonctionnement de Ccc2 pour préciser les régulations susceptibles d'intervenir dans la cellule. Ce travail est réalisé en collaboration avec le laboratoire du Professeur A. Vieyra à Rio de Janeiro [Valverde et al., 2008 ; Valverde et al., 2010].

Sélectivité et détoxication

Chacune des protéines membranaires que nous étudions est spécifique de l'ion qu'elle transporte ; cette spécificité est plus ou moins stricte, par exemple, CadA peut transporter du Zn(II) et Ccc2, de l'Ag(I). Cependant, CadA ne transporte ni Co(II) ni Cu(I). Si le déterminant principal de la sélectivité ionique des ATPases de type PIB est le site de transport membranaire, on trouve sur la plupart de ces transporteurs, un second domaine d'interaction avec les métaux situé à l'extrémité N-terminale de la protéine. Ce domaine possède une structure de type ferredoxine et une séquence consensus Cys-x-x-Cys (
Figure 4). Dans le cytosol, de petites protéines appelées métallochaperonnes, telle Atx1 chez la levure, fixent le Cu(I) par la même séquence consensus. Les chaperonnes et les domaines N-terminaux des ATPases forment une famille de protéines ayant le même repliement et le même motif de liaison des métaux lourds (Figure 4); cependant, elles fixent selon les cas, Cu(I), Cd(II), Zn(II) ou Hg(II). Nous nous intéressons à ces domaines tant d'un point de vue structural que fonctionnel et en particulier au rôle qu'ils peuvent jouer dans la sélectivité du transporteur pour les métaux [Morin et al., 2005 ; Banci et al., 2006 ; Miras et al., 2008 ; Poger et al., 2008 ; Morin et al., 2009].



Figure 4 : Structure des domaines N-terminaux de liaison des métaux (MBD) de trois ATPases de type PIB. CadA, ATPase-Cd(II) de L. monocytogenes, ZntA, ATPase-Zn(II) d'E. coli, CopA, ATPase-Cu(I) de B. subtilis. En jaune les acides aminés impliqués dans la coordination du métal. En bleu, région hydrophobe conservée dans les trois domaines.

Techniques

Biologie moléculaire - expression hétérologue dans divers systèmes (bactéries, levures, cellules d'insectes) - culture cellulaire - génétique de la levure - purification de protéines - biochimie - spectroscopies d'absorption, fluorescence, dichroïsme circulaire, diffusion de lumière - immunofluorescence - PCR quantitative.