Pour mieux comprendre le fonctionnement du Vivant, les biologistes ont besoin d’outils qui leur permettent de détecter sélectivement et de quantifier les molécules qui participent aux mécanismes complexes mis en jeu dans les cellules. A cet égard, les sondes fluorescentes sont des outils particulièrement intéressants car la fluorescence est une méthode de détection très sensible, peu coûteuse et facile à mettre en œuvre au niveau du laboratoire.
Des chercheurs de notre laboratoire ont montré qu’il était possible de concevoir une sonde fluorescente originale pour détecter de courtes séquences d’ARN. Pour cela, ils ont utilisé un domaine de reconnaissance présent sur une protéine et qui est capable de lier sélectivement la séquence d’ARN d’intérêt. Ils se sont ainsi intéressés à la séquence UUAUUUAUU présente sur certains ARN messagers. Cette séquence de 9 bases est trop courte pour être détectée par des sondes à ARN classiques construites à partir d’un ADN. Pour pallier cette limitation, les chercheurs ont adopté une approche différente. Ils ont montré qu’il était possible d’utiliser le domaine de reconnaissance de la tristetraprolin (protéine TTP ; Figure) afin de concevoir une sonde fluorescente capable de reconnaître sélectivement la séquence ARN cible. Ils ont ainsi synthétisé un polypeptide de 68 acides aminés correspondant au domaine de la protéine TTP qui reconnaît la séquence UUAUUUAUU. Cette synthèse réalisée par voie chimique leur a permis de greffer deux molécules fluorescentes sur le polypeptide. Le polypeptide synthétique adopte le même repliement que la protéine TTP native, et comme elle, change de conformation lorsqu’il se lie à la séquence ARN cible. La distance entre les deux molécules fluorescentes est alors modulée, ce qui conduit à augmenter l’émission de fluorescence. De plus, la sonde ainsi synthétisée conserve toutes les propriétés de reconnaissance de la protéine TTP native pour l’ARN (affinité, sélectivité, vitesses de liaison et de décrochage), propriétés qui sont essentielles pour l’utilisation de sondes fluorescentes
in vivo pour des applications de microscopie confocale sur des cellules.
La séquence UUAUUUAUU se trouve dans certains ARN messagers, par exemple celui du TNF-α, une cytokine pro-inflammatoire impliquée dans les processus inflammatoires ou certains cancers. Cette séquence est le lieu de fixation de la protéine tristetraprolin (TTP) qui régule la production de TNF-α en contrôlant le devenir (destruction ou traduction) de son ARN messager.
Le domaine de reconnaissance de l’ARN de la protéine TTP change de conformation en se liant à sa cible, les deux molécules fluorescentes greffées sur le domaine de reconnaissance se rapprochent et la sonde s’allume.