Thèse soutenue le 24 mai 2023 pour obtenir le grade de docteur de l'Université Grenoble Alpes - Spécialité : Chimie inorganique et Bio inorganique

Résumé :
Le projet NikAGARA s’est articulé autour de la mise au point de métalloenzymes artificielles et de la catalyse hétérogène. Dans le but de contribuer au développement des réactions abiotiques catalysées par des metalloenzymes, nous nous sommes intéressés aux réactions d’époxydation d'alcène et de cycloaddition du CO₂, dans le cadre d’un réaction cascade.
Pour y parvenir, La stratégie a consisté à introduire dans des cristaux de protéine NikA deux sites actifs artificiels, chacun associé à une de ces deux réactions. Le challenge était de construire ces deux sites par des méthodologies d’ancrage orthogonales : nous avons alors dans un premier temps testé une nouvelle série d’époxydases produites selon deux modes de préparation distincts à partir de la protéine NikA. Le premier, maitrisé par le consortium, repose sur des interactions supramoléculaires entre les résidus présents dans la cavité de la protéine NikA et des complexes complexe de Mn, jouant le rôle de site actif. Le second est basé sur la modification covalente d'une cystéine introduite dans NikA par mutagenèse dirigée. Une réaction de Michael d’un substituant d’un ligand salen avec la seule cystéine de la protéine NiKA a alors été démontrée pour la première fois dans des cristaux de NiKA. Cinq nouvelles époxydases artificielles ont démontré des activités intéressantes avec l'acide peracétique ou le dioxygène comme oxydant. Un des principaux acquis de cette partie est la démonstration du mode d’insertion covalente, démontré par un faisceau de spectroscopies dont la diffraction X et la spectrométrie de masse. Egalement, l'optimisation des essais d'ancrage covalent d’un complexe Mn(salen) modifié sur le mutant NikA-H416C autorise un excès énantiomérique de 90 % sur l'époxydation aérobie du cis-β-méthylstyrène. La localisation des cystéines au sein de la protéine influence fortement le rendement de la réaction, soulignant l’importance de l’accès au site lors de la construction du site actif et sans doute de l’approche des substrats. Dans un second temps, le mutants cystéine de NikA associés à un complexe Co(salen) lié de manière covalente, ont conduit à la production d’enzymes pour la cycloaddition du CO₂ qui se sont avérées efficaces dans des conditions assez douces. Enfin, la preuve de concept de catalyse duale à partir de deux sites artificiels dans des cristaux de protéine a été démontrée. L'association du complexe Co(salen) avec un complexe d'époxydation portant un mode d’ancrage orthogonal (interaction supramoléculaire) sur un échafaudage mutant NikA unique, a permis la création d’une enzyme duale capable de catalyser une transformation d’époxydation-cycloaddition du CO₂ en cascade.
S’il reste encore un travail conséquent d’optimisation dans chaque approche citée, ces résultats permettent d’ouvrir de nouveaux champs d’applications pour les enzymes artificielles en biologie de synthèse. Elle démontre aussi une nouvelle approche de la catalyse cascade hétérogène bioinspirée.

Jury :
Président : Fabrice Thomas
Rapporteure : Christelle Hureau
Rapporteur : Franck LAaunay
Examinatrice : Yasmina Mekmouche
Examinateur :  Frédéric Avenier
Invitée :  Christine Cavazza
Directeur de thèse : Stéphane Ménage

Mots clés :
NikAGARA, métalloenzymes artificielles, catalyse hétérogène, réactions abiotiques, réactions d’époxydation d'alcène, cycloaddition du CO₂, protéine NikA

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